科研服務(wù)

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。CpG位點(diǎn)在基因組是不常見的，主要密集于接近基因啟動(dòng)子的位置，統(tǒng)稱為CpG島CpG島大約含有500多個(gè)堿基，位于基因的啟動(dòng)子區(qū)或第一個(gè)外顯子區(qū)。脊椎動(dòng)物DNA的甲基化狀態(tài)與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的下降。


甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。

特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測(cè)特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

產(chǎn)品內(nèi)容

項(xiàng)目類型 檢測(cè)方法 DNA甲基化分析服務(wù)價(jià)格
DNA甲基化服務(wù) BSP-10個(gè)克隆 DNA提取和亞硫酸氫鹽處理 片段擴(kuò)增+10克隆測(cè)序
140元/樣品 800元/樣本/片段
MSP-電泳法 請(qǐng)?jiān)儍r(jià) 請(qǐng)?jiān)儍r(jià)

實(shí)驗(yàn)流程

  • 1、樣品用Qiagen試劑盒進(jìn)行基因組 DNA 提取與重亞硫酸鹽處理（包括純化和脫磺基反應(yīng)）。
  • 2、用甲基化引物設(shè)計(jì)相關(guān)軟件在甲基化區(qū)域設(shè)計(jì) 甲基化特異性的引物（ primer Ⅰ ）或非甲基化的引物（ primer Ⅱ ） 引物 2 對(duì)。
  • 3、 進(jìn)行特異性的 PCR 擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物。
  • 4、檢測(cè) MSP 擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化 DNA 鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；若用針對(duì)處理后的非甲基化 DNA 鏈的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。

亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。

亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA 甲基化方法，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。

特點(diǎn)：精確度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出甲基化的程度百分比。

實(shí)驗(yàn)流程

  • 1、樣品用Qiagen試劑盒進(jìn)行基因組 DNA 提取與亞硫酸鹽處理（包括純化和脫磺基反應(yīng)），使 DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。
  • 2、用甲基化引物設(shè)計(jì)相關(guān)軟件在甲基化區(qū)域兩端設(shè)計(jì)引物。
  • 3、進(jìn)行基因擴(kuò)增及 PCR 產(chǎn)物回收。
  • 4、PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序或克隆測(cè)序（定量分析），分析每個(gè) CpG 島甲基化情況 。
  • 5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。與未甲基化的 DNA 樣本進(jìn)行比對(duì)。

樣品要求

  • DNA樣品：濃度≥100ng/μl、體積≥20μl的總DNA樣品，DNA抽提：血液20元/樣本；新鮮組織30元/樣本；石蠟包埋組織50元/樣本；
  • 血液樣品：請(qǐng)?zhí)峁?00μl抗凝血；采用標(biāo)準(zhǔn)的采樣管， EDTA 抗凝或枸椽酸鈉抗凝；
  • 組織樣品：請(qǐng)?zhí)峁┳懔康慕M織樣品（≥300mg）；
  • 細(xì)胞（≥106 ）；
  • 甲基化位點(diǎn)信息：免費(fèi)提供甲基化島分析。

提供報(bào)告

  • MSP：引物序列、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、包括MSP產(chǎn)物的電泳圖片；
  • BSP：引物序列、測(cè)序峰圖、陽性克隆質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)報(bào)告；

甲基化研究思路

尋找甲基化位點(diǎn)
  • 甲基化二代測(cè)序?qū)ふ壹谆稽c(diǎn)
    對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行甲基化芯片檢測(cè)，找到相關(guān)的甲基化位點(diǎn)；
    一些相關(guān)研究顯示某些基因存在表達(dá)量降低的現(xiàn)象，可預(yù)測(cè)該基因是否存在CpG島；
    根據(jù)文獻(xiàn)尋找相關(guān)基因的甲基化位點(diǎn)。
  • 驗(yàn)證甲基化位點(diǎn)，并進(jìn)行甲基化程度分析
    采用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本進(jìn)行甲基化驗(yàn)證；
    MSP方法：可進(jìn)行特定位點(diǎn)甲基化驗(yàn)證，適用于甲基化芯片后的結(jié)果，無法進(jìn)行甲基化程度分析；
    BSP克隆測(cè)序法：驗(yàn)證某些相關(guān)基因的甲基化位點(diǎn)，并計(jì)算出精確的甲基化程度百分比；
    HRM法：適用于大批量樣本甲基化驗(yàn)證，并能計(jì)算出甲基化程度范圍；
    焦磷酸測(cè)序法：驗(yàn)證某些相關(guān)基因的甲基化位點(diǎn)，并計(jì)算出精確的甲基化程度百分比。
  • 分析甲基化位點(diǎn)與研究的相關(guān)性
    根據(jù)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本的檢測(cè)結(jié)果，分析與研究的相關(guān)性；
    比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相同甲基化位點(diǎn)甲基化是否有差異；
    比對(duì)對(duì)照組合實(shí)驗(yàn)組相同基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度是否有差異。
  • 驗(yàn)證啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的基因的表達(dá)量變化
    采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量，如果表達(dá)量降低，可能由于啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化導(dǎo)致的，從而影響該基因所在的某些通路，導(dǎo)致一些疾病，或表型發(fā)生變化；如果沒有發(fā)生變化，可能由于發(fā)生甲基化的區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子之間關(guān)聯(lián)不是很密切，從而不會(huì)影響基因的表達(dá)。
    DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。CpG位點(diǎn)在基因組是不常見的，主要密集于接近基因啟動(dòng)子的位置，統(tǒng)稱為CpG島CpG島大約含有500多個(gè)堿基，位于基因的啟動(dòng)子區(qū)或第一個(gè)外顯子區(qū)。脊椎動(dòng)物DNA的甲基化狀態(tài)與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的下降。

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