科研服務(wù)

質(zhì)粒DNA作為基因遞送的非病毒載體，在傳染性疾病預(yù)防性疫苗、腫瘤治療、蛋白替代治療等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。但治療性質(zhì)粒DNA亦面臨一些難題，如質(zhì)粒DNA存在整合到靶標(biāo)細(xì)胞基因組上的風(fēng)險；質(zhì)粒DNA序列上存在的CpG基序可能具有免疫刺激效應(yīng)； 存在于人體中的細(xì)菌可能會發(fā)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致質(zhì)粒DNA復(fù)制，從而使體內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；此外，用限制性內(nèi)切酶切割或PCR擴(kuò)增獲得的僅含有轉(zhuǎn)錄單位的DNA片段，遇到核酸外切酶極易發(fā)生降解。


LC-dsDNA（Linear, covalent closed, double strand DNA），即線性共價閉合雙鏈DNA，在兩端具有自由的、非連接的3' 和5'末端，是一種小的、線性雙鏈共價閉合DNA 結(jié)構(gòu)。LC-dsDNA不攜帶骨架信息，僅表達(dá)目的基因，分子量小，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高； 且在抗原的表達(dá)及小鼠體內(nèi)能夠觸發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫的水平媲美質(zhì)粒DNA疫苗達(dá)到的效果，可以提供有效的抵抗病毒感染的保護(hù)效力。將 LC-dsDNA 導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中，可實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)特定基因的引入和表達(dá)，在臨床應(yīng)用及安全性上有較大優(yōu)勢。


與傳統(tǒng)DNA質(zhì)粒相比，LC-dsDNA具有以下優(yōu)勢：

  • 1)剔除質(zhì)粒骨架及無關(guān)外源序列，降低風(fēng)險，安全性更高；
  • 2)降低CpG基序，降低觸發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險；
  • 3)不受質(zhì)粒骨架拷貝數(shù)影響，產(chǎn)量更高；
  • 4)在哺乳動物體內(nèi)表達(dá)更好，每次轉(zhuǎn)染所需DNA量更少。


與PCR擴(kuò)增或酶切獲得的DNA片段相比，LC-dsDNA 3’末端自身環(huán)化，形成共價閉合結(jié)構(gòu)，免受核酸外切酶攻擊，穩(wěn)定性更高。


通用生物擁有專業(yè)的基因及質(zhì)粒生產(chǎn)、工藝開發(fā)團(tuán)隊，在科研級LC-dsDNA定制合成方面具有豐富的經(jīng)驗，可提供從基因合成、質(zhì)粒制備、LC-dsDNA合成一站式服務(wù)。 可合成制備200-8000 bp LC-dsDNA ，并可針對不同的下游應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化定制。交付的產(chǎn)品具有高產(chǎn)量、高純度、低雜質(zhì)殘留等特點，可應(yīng)用于核酸（DNA、mRNA）疫苗及藥物研發(fā)、細(xì)胞與基因治療（GCT）等諸多領(lǐng)域的早期研究階段。

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)步驟 服務(wù)內(nèi)容 周期 交付內(nèi)容
1.基因合成及質(zhì)粒制備 基因合成、質(zhì)粒構(gòu)建 1-2周

a) LC-dsDNA產(chǎn)品

b) COA 文件

c) 序列驗證文件

質(zhì)粒抽提
2.LC-dsDNA合成 體內(nèi)或體外合成 3-4周
純化回收
3.質(zhì)控 默認(rèn)QC+額外QC項（可定制） 詳詢

QC項目

QC 項目 檢測方法
默認(rèn) 外觀 目測
LC-dsDNA產(chǎn)品序列完整度 瓊脂糖凝膠電泳
序列準(zhǔn)確性 DNA模板Sanger 測序
LC-dsDNA DNA濃度 Nano drop定量
A260/280 Nano drop定量
內(nèi)毒素含量 凝膠鱟試劑法
生物負(fù)載 TSA 48h平板檢測
額外（可選）* 模板DNA殘留 qPCR
蛋白殘留 ELISA法；BCA蛋白定量；Qubit法（可選）
DNA酶殘留 DNase檢測
純度 CE/HPLC
需支付額外QC費用。如需更多其它QC項，可支持定制

服務(wù)應(yīng)用

1)mRNA IVT 的模板


以LC-dsDNA為mRNA體外合成模板，細(xì)菌質(zhì)粒殘留是傳統(tǒng)方法的1/100以下。通用生物可提供70-150 polyA模板的快速合成服務(wù)。


2)基因編輯


LC-dsDNA可作為CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)中基因敲入的HDR模板。線性閉合末端結(jié)構(gòu)，免受細(xì)胞內(nèi)核酸外切酶攻擊，提高編輯效率，同時閉合結(jié)構(gòu)降低非同源末端連接的風(fēng)險。


3)基因治療非病毒載體


作為基因遞送的非病毒載體，LC-dsDNA具有更高的載量，更大的轉(zhuǎn)基因能力，毒性低，免疫原性反應(yīng)小，安全性更高。

案例展示

LC-dsDNA合成


圖a.大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)合成LC-dsDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測


圖b. LC-dsDNA純化后凝膠電泳

注. 圖a. 1、2為誘導(dǎo)前質(zhì)粒DNA凝膠電泳檢測；3、4、5、6為誘導(dǎo)后DNA凝膠電泳檢測

注. 圖b. 7、8、9、10為4個樣本純化后凝膠電泳檢測.


LC-dsDNA純度檢測


圖c. Agilent 5200 分析儀檢測LC-dsDNA純度

Agilent 5200 分析儀檢測純度達(dá)96.8%。


細(xì)胞轉(zhuǎn)染鑒定



LC-dsDNA EGFP轉(zhuǎn)染24h

          

mRNA-EGFP 轉(zhuǎn)染24h

經(jīng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)鑒定，LC-dsDNA EGFP表達(dá)水平與mRNA-EGFP相近，均實現(xiàn)高表達(dá)

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