科研服務(wù)

熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。 熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，可以得到熒光擴(kuò)增曲線，計(jì)算待測(cè)樣品初始模版的量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、絕對(duì)定量和定性分析。

產(chǎn)品內(nèi)容

項(xiàng)目類型 檢測(cè)方法 熒光定量PCR服務(wù)價(jià)格 周期
熒光定量PCR服務(wù) SYBR Green染料法taqman探針法 位點(diǎn)調(diào)試費(fèi) RNA提取+逆轉(zhuǎn)錄 定量pcr三復(fù)孔 5-8個(gè)工作日
100元/基因 70元/樣品 70元/基因/樣品
備注:
1、絕對(duì)定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線另外收取(300元/基因)。
2、探針法，探針需另外收取費(fèi)用(500元/條，默認(rèn)FAM、BHQ)。

檢測(cè)分類

  • 1. mRNA表達(dá)量水平檢測(cè)：相對(duì)定量法。
  • 2. MicroRNA表達(dá)量水平檢測(cè)：通過設(shè)計(jì)特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR可以精確檢測(cè)微量樣品中microRNA表達(dá)水平。內(nèi)參基因一般用U6。
  • 3. 基因拷貝數(shù)檢測(cè)：如檢測(cè)樣品中不同細(xì)菌含量、基因工程菌目的基因拷貝數(shù)、環(huán)境中耐藥基因檢測(cè)等。采用絕對(duì)定量法。

定量方式

  • 1. 絕對(duì)定量：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度的檢測(cè)樣品進(jìn)行絕對(duì)量（起始拷貝數(shù)）分析。
  • 2. 相對(duì)定量：以內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化，通常用來對(duì)mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。一般采用2－ΔΔ Ct 法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)三次。

檢測(cè)方法

1. SYBR Green Ⅰ法：

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

2. TaqMan探針法：

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

樣品要求

  • 1、須提供新鮮的足量材料（細(xì)胞數(shù)106個(gè)以上，組織100 mg以上），樣品-70℃快遞至本公司（干冰或液氮運(yùn)送，以保證樣品質(zhì)量），亦可提供保證質(zhì)量的DNA或RNA樣品（2 μg以上）；
  • 2、提供靶基因信息，包括基因序列或GenBank Accession Number等。
  • 3、提供詳細(xì)的背景資料，生物物種信息（Human、Mouse、Rat等）、DNA/RNA來源、基因豐度等。

提供結(jié)果

引物和探針及序列，膠圖，原始數(shù)據(jù)（包括擴(kuò)增曲線和熔解曲線）、數(shù)據(jù)分析結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

檢測(cè)周期

常規(guī)檢測(cè)任務(wù)2－3周內(nèi)完成，具體情況根據(jù)要檢測(cè)的基因和樣本數(shù)而定。

常見問題

Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？

A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測(cè)使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的內(nèi)參。對(duì)于一些無法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？

A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計(jì)引物。

Q: 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？

A：絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。

Q: 每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針？

A：每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面。

首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長檢測(cè)的定量PCR儀如激光管-CCD類型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒有限制的。如果信號(hào)的采集要通過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以ABI公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長檢測(cè)的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。

其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使用，必須其激發(fā)波長既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證信號(hào)不重疊干擾，能夠區(qū)分清楚?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組4到5種熒光的水平。

第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種熒光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來說，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測(cè)的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。

第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達(dá)，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個(gè)內(nèi)對(duì)照，3色也就足夠了。

最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度，二是節(jié)省反應(yīng)成本。同時(shí)測(cè)定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時(shí)加入8-10條引物。在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要考慮到盡量減少這些引物之間的競(jìng)爭和抑制等多種干擾，平衡各對(duì)引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花費(fèi)大量時(shí)間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優(yōu)化反應(yīng)條件。如果實(shí)驗(yàn)規(guī)模不大，在總體上可能反而不合算。

在實(shí)際應(yīng)用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優(yōu)化。比較切合實(shí)際的是2到3重反應(yīng)，引物和探針的設(shè)計(jì)不太困難，反應(yīng)條件的優(yōu)化也不太麻煩，同時(shí)降低了成本。

Q: 什么是雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法？

A：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指將內(nèi)參基因及目的基因分別稀釋5個(gè)點(diǎn)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確保擴(kuò)增效率，再根據(jù)絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)計(jì)算差異表達(dá)情況。

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